Biologia molecolare

Storia della biologia molecolare. I legami Chimici.
- Acidi nucleici. Struttura del DNA. Proprietà chimico-fisiche a topologia del DNA.
- Acidi nucleici. Struttura dell'RNA.
- Codice genetico e organizzazione del genoma eucariotico. Impacchettamento del genoma umano.
- La struttura delle proteine, interazione proteine con acidi nucleici.
- La replicazione del DNA.
- La riparazione del danno al DNA.
- Ricombinazione del DNA.
- La trascrizione nei procarioti e negli eucarioti.
- La regolazione della trascrizione negli eucarioti.
- Regolazione epigenetica della trascrizione.
- Organizzazione 3D del genoma.
- Maturazione dell'RNA.
- Splicing dell'RNA e cenni di editing.
- Apparato di traduzione, traduzione e regolazione della traduzione.
- Cenni di bioinformatica.

Tecniche:
- Tecniche di base per gli acidi nucleici
- Tecniche di sequenziamento del DNA
- Tecnologie per lo studio della regolazione epigenetica
- Tecniche basate su CRISPR-cas9
- Tecniche per lo studio delle proteine

LA BIOLOGIA MOLECOLARE: SCIENZE DELLA VITA E BIOTECNOLOGIE
Breve storia della biologia molecolare dalla scoperta del DNA fino alle frontiere della biologia attuale e alla nascita delle biotecnologie.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
Struttura del DNA. Basi azotate, nucleosidi e nucleotidi. Il legame fosfodiesterico. Diverse forme della doppia elica: DNA-B, -A e -Z. Come si formano i solchi maggiore e minore nel DNA-B. Proprietà chimico-fisiche del DNA. Denaturazione, rinaturazione e ibridazione. Forze che stabilizzano il DNA. Importanza dei legami deboli. La topologia del DNA: superavvolgimento e parametri che lo descrivono (Linking number, Twist, Writhe e densità della superelica. Il superavvolgimento negativo è il piu' comune, perchè? Le DNA topoisomerasi. Meccanismo catalitico delle topoisomerasi di tipo I e II.
Struttura dell'RNA. La chimica del ribosio e la stabilità dell'RNA. L'idrolisi alcalina. Strutture secondarie e terziarie dell'RNA. Le varie funzioni degli RNA nella cellula. I ribozimi.

Cenni alla struttura di proteine e alle interazioni proteine-DNA di tipo sequenza-sepcifco. Motivi strutturali di legame al DNA: HTH, Zinc-finger, Leucine zipper, bHLH. L'interazione fra proteine e RNA.

INTERAZIONE FRA MACROMOLECOLE
Assemblaggio del DNA in cromosomi: struttura della cromatina. Il nucleosoma: composizione e struttura. Caratteristiche degli istoni. Organizzazione di ordine superiore della cromatina. Il rimodellamento dei nucleosomi e le modificazioni degli istoni: writers, erasers e readers. Il codice istonico. Riepilogo sulla struttura dinamica della cromatina.

Tecniche di Base di Biologia molecolare - 1
Enzimi usati nelle tecniche del DNA ricombinante. Gli enzimi di restrizione di tipo II: loro nomenclatura, classificazione, frequenza di taglio e tipo di taglio generato. Mappe di restrizione virtuali. Come monitorare la frammentazione del DNA attraverso l'elettroforesi convenzionale in gel di agarosio. Identificazione di sequenze specifiche di DNA mediante ibridazione di frammenti di DNA denaturato trasferiti da gel a filtro (Southern blot/ hybridization).
Caratteristiche dei vettori di clonaggio plasmidici. Principi di clonaggio. Strategie per prevenire la richiusura dei vettori. Clonare per esprimere una proteina di interesse (elementi presenti in un vettore di espressione). Costruzione di librerie genomiche e loro utilizzi.
La polymerase chain reaction (PCR): principio dell'amplificazione in vitro di DNA. Cicli di temperatura. Le DNA polimerasi termostabili hanno permesso l'automazione.
Sequenziamento rapido di DNA: il metodo tradizionale di sequenziamento enzimatico di DNA (Sanger) e la sua automazione. Nuovi soluzioni: principio del pirosequenziamento e sviluppo di tecnologie di sequenziamento innovative (NGS).

ORGANIZZAZIONE DEI GENOMI
L'era -omics. Confronto per dimensioni, organizzazione e densità genica fra i principali genomi sequenziati di procarioti e eucarioti. Le relazioni con la complessità biologica degli organismi. Organizzazione del genoma umano: geni, regioni intergeniche, sequenze ripetute in tandem e interdisperse nel genoma (DNA satellite, microsatelliti, minisatelliti, sequenze derivate da elementi trsponibili), pseudogeni e ipotesi sulla loro origine.

LA TRASCRIZIONE: MECCANISMI MOLECOLARI
Cenni generali sulla trascrizione. La trascrizione nei procarioti. L'RNA polimerasi batterica e il promotore batterico canonico. La funzione del fattore sigma. Parametri che descrivono la reazione di formazione del complesso binario chiuso, la tappa di isomerizzazione, l'inizio di trascrizione e l'evasione dal promotore.
La trascrizione in eucarioti: RNA polimerasi I, II e III e loro specializzazione. Struttura dei promotori e fattori agenti in trans: il promotore del gene per il precursore degli rRNA. Promotori riconosciuti da RNA pol III. La struttura del Core promotor: elementi in cis e fattori generali di trascrizione per l'RNA pol II (TFIID,A,B,F,E,H). La TATA box-binding protein (TBP) e il suo legame al DNA. L'assemblaggio del macchinario trascrizionale basale. La fosforilazione del CTD dell'RNA pol II. Elementi prossimali e distali. Il mediatore. Gli attivatori trascrizionali e i co-attivatori. Influenza della struttura della cromatina nel controllo trascrizionale. Modello riassuntivo.

GLI RNA CELLULARI E LA MATURAZIONE DEI TRASCRITTI
Modificazioni co-trascrizionali dei trascritti primari dell'RNA pol II (capping, splicing e poliadenilazione) e ruolo del CTD. Struttura del Cap e sua formazione al 5' del trascritto. Poliadenilazione: segnale di poliadenilazione e meccanismo molecolare di formazione della coda di poly(A) al 3' del trascritto. Terminazione della trascrizione accoppiata alla poliadenilazione. Lo splicing dei pre-mRNA: caratteristiche degli introni GU-AG dei pre-mRNA. Lo splicing dal punto di vista chimico. Lo splicing operato dallo spliceosoma (snRNPs e proteine). Gli introni di gruppo I, II e III. Self-splicing. Difetti di splicing e malattie. Splicing alternativo dei pre-mRNA. I regolatori dello splicing: proteine SR e hnRNP. Le ipotesi sull'origine degli introni e i vantaggi di aver mantenuto gli introni. Relazione fra numero di introni per gene e complessità biologica. Riepilogo su struttura gene eucariotico e mRNA: l'esempio del gene della beta-globina. Le regioni 5'- UTR e 3'-UTR degli mRNA eucariotici.
Trasporto degli mRNAdal nucleo al citoplasma.
La maturazione di altri trascritti. Cenni alla maturazione degli rRNA. Maturazione dei precursori dei tRNA.
Il fenomeno dell'RNA interference. Maturazione dei miRNA. primary pre-RNA, pre-miRNA e miRNA e formazione complesso RISC. Funzioni dei miRNA nella cellula. Gli small interference RNA (siRNA) e cenni alle loro applicazioni nello spegnimento genico.

Tecniche di biologia molecolare - 2
Isolamento di (polyA)+ RNA. L'ottenimento di cDNA. Le librerie a cDNA.
Tecniche per la valutazione dell'espressione di singoli geni. Northern blot, RT-PCR, cenni a qReal time-RT PCR. Analisi in larga scala del trascrittoma: cenni a microarray e RNA sequencing.
TRADUZIONE
Il macchinario della traduzione. I ribosomi. I tRNA: splicing dei precursori dei tRNA. Struttura dei tRNA. Le aminoacil-tRNA sintetasi. Il meccanismo della traduzione in procarioti. L'inizio della traduzione in eucarioti. Proteine G coinvolte nella traduzione.
Esempio di controllo traduzionale a feed-back negativo in procarioti: le proteine ribosomali. Controllo traduzionale generale in eucarioti: le proteine eIF4BP e eIF2 e la loro regolazione mediante fosforilazione. Regolazione della traduzione di singoli mRNA: il caso delle uORF nell'mRNA di GCN4 di lievito, il controllo della traduzione dell'mRNA della ferritina: ruolo delle 5'-UTR e 3'-UTR sulla traducibilità e sulla stabilità di un mRNA. Regolazione da miRNA.

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DELLE PROTEINE
Il repertorio delle modificazioni post-traduzionali incrementa la diversità del proteoma. Smistamento e localizzazione delle proteine. Trasporto nucleo-citoplasma. La traslocazione co-traduzionale a livello dell'ER. La via secretiva. Le modificazioni post-traduzionali: la N-glicosilazione, la fosforilazione, l'acetilazione e la metilazione delle proteine. Importanza della glicosilazione in glicoproteine di interesse terapeutico.

REPLICAZIONE DEL DNA: I MECCANISMI MOLECOLARI
Proprietà universali delle DNA polimerasi. Struttura, domini e meccanismo catalitico. La termodinamica della reazione di polimerizzazione. Come si realizza la selettività: il controllo cinetico. L'attività di proof-reading. Le polimerasi replicative e specializzate. L'enzimologia della replicazione del DNA in procarioti ed eucarioti: il replisoma. L'inizio della replicazione. Il modello del replicone-iniziatore. Struttura delle origini. Il controllo dell'inizio della replicazione in batteri e in lievito. La terminazione della replicazione. I telomeri. Le telomerasi e il loro funzionamento.

RIPARAZIONE AI DANNI AL DNA
I vari tipi di danno al DNA. Principali meccanismi di riparazione del DNA: riparazione diretta, per escissione di basi (BER), per escissione di nucleotidi (NER). Riparazione dei mismatch (MMR) in E.coli. Meccanismi di tolleranza al danno al DNA. La sintesi di DNA translesione (TLS) e le TLS DNA polimerasi. Riparazione delle rotture delle rotture al doppio filamento (DSB) per non-homologous end joining (NHEJ) o ricombinazione omologa.