Metodologie cellulari e biochimiche

A.A. 2019/2020
6
Crediti massimi
72
Ore totali
SSD
BIO/10 BIO/13
Lingua
Italiano
Obiettivi formativi
L'insegnamento si propone di:
- fornire una adeguata descrizione delle tecniche utilizzate per la crescita e la manipolazione di cellule "in vitro" e sull'utilizzo dei diversi tipi di coltura cellulare in campo biotecnologico;
- presentare i principi e le applicazioni dei metodi e degli approcci di base ed avanzati per lo studio di molecole biologicamente attive e di processi biochimici e molecolari, con particolare riferimento agli approcci biotecnologici impiegati nella moderna ricerca biochimica e biomedica;
- approfondire dal punto vista metodologico le conoscenze acquisite nelle altre discipline del corso di studi svolte nei semestri precedenti (Biologia generale e cellulare, Biochimica e Biologia molecolare).
Con la parte teorica, l'insegnamento contribuisce al consolidamento delle conoscenze di base a livello molecolare e cellulare dei sistemi viventi. Attraverso le esercitazioni di laboratorio gli studenti hanno l'opportunità di familiarizzare con la manipolazione di cellule in coltura in condizioni di sterilità e con l'uso di tecniche biochimiche e bio-molecolari di base, in linea con i profili professionali e gli sbocchi occupazionali previsti per l'intero percorso formativo.
Inoltre, l'insegnamento contribuisce a fornire le basi per il proseguimento degli studi nei corsi di laurea magistrale in area biotecnologica e bio-medica.
Risultati apprendimento attesi
Al termine dell'insegnamento lo studente dovrà aver acquisito le nozioni teoriche e pratiche relative alle principali metodologie cellulari e biochimiche in uso nei laboratori di ricerca e di analisi in ambito bio-medico. In particolare, lo studente dovrà aver acquisito competenze di base per la manipolazione di cellule eucariotiche in condizioni di sterilità e la capacità di eseguire protocolli standard per l'analisi di proteine e acidi nucleici. Inoltre, lo studente dovrà essere in grado di: individuare le tecniche o gli approcci sperimentali più idonei in funzione del contesto di applicazione; individuare la soluzione corretta o più adeguata attraverso simulazioni di casi sperimentali; analizzare in modo critico i risultati ottenuti in seguito all'applicazione delle tecniche studiate e/o messe in pratica durante le esercitazioni di laboratorio.
Programma e organizzazione didattica

Edizione unica

Periodo
Secondo semestre
Programma
METODOLOGIE CELLULARI
DIDATTICA FRONTALE
- Il laboratorio per colture cellulari eucariotiche
La sterilità, i dispositivi di protezione individuale e di protezione collettiva, le cappe di sicurezza biologica, gli incubatori, piccola strumentazione e supporti per colture cellulare. Misure di sicurezza e rischi associati.
Tecniche di sterilizzazione a calore secco e a calore umido, filtrazioni.
L'ambiente delle colture: substrati, medium di coltura, temperatura, fattori di crescita, tipi di siero e additivi chimici.

- Le colture cellulari.
Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari.
Linee cellulari primarie: ottenimento e mantenimento. Disaggregazione dei tessuti e colture primarie. Separazione e caratterizzazione di specifici tipi cellulari presenti in un tessuto.
Linee cellulari stabilizzate e/o immortalizzate: ottenimento e mantenimento. I fattori di trasformazione, l'immortalizzazione di cellule mediata da oncogeni, i sistemi ibridi ottenuti da fusioni cellulari. Immortalizzazione specifica con agenti trasformanti: tumorigenesi diretta.
Cellule staminali indotte pluripotenti (iPSC). Ottenimento, mantenimento e differenziamento.
Metodi di coltura (sospensione, adesione, coltura in monostrato e 3D), substrati per colture cellulari in adesione, analisi della morfologia delle colture cellulari. Analisi delle curve di crescita di una coltura cellulare, la subcoltura, distacco meccanico o enzimatico, la conta cellulare e la semina, il congelamento delle linee cellulari.

- Utilizzo di colture batteriche per la produzione di plasmidi per colture cellulari.
Condizioni di crescita di E.Coli, terreni liquidi e solidi, curve di crescita, congelamento e conservazione, trasformazione con DNA plasmidico, estrazione del DNA. Esempi di vettori batterici: plasmidi, batteriofago lambda e cosmidi. Elementi essenziali per un plasmide (origine di replicazione, multiple cloning site, il promotore, marcatori di selezione, l'operone lattosio e la beta-galattosidasi), strategie di clonaggio. Il fago lambda e suoi utilizzi per il clonaggio di DNA esogeno. I cosmidi.

- Tecniche di trasfezione cellulare per lo studio dell'espressione genica e per l'analisi di proteine.
I cargo genetici per sovraespressione o silenziamento genico: plasmidi a DNA (pDNA classici, enhanced episomal vectors, minicircle), oligonulceotidi antisenso, siRNA e micro-RNA.
Vettori di trasfezione non virali: metodi chimici (calcio cloruro, DEAE-destrano, lipofezione) e metodi fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun).
Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV, Herpes Simplex-based. Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus.
Trasfezioni transienti e stabili; vettori plasmidici, vettori di trasformazione con promotori virali, per espressione inducibile (tet on/tet off), sistemi reporter.
Il genome editing: le homing-endonucleases, i sistemi zinc-fingers, i TALENs, la tecnologia CRISPR/Cas9.

- La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari.
Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti. Il microscopio a fluorescenza e confocale. Immunocitochimica ed immunofluorescenza: fissaggio delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli, per misurare attività cellulari.
Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET, FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP.

- La citofluorimetria.
Introduzione alla citofluorimetria, il citofluorimetro, parametri misurabili (densità di una sospensione cellulare, complessità, dimensione e forma delle cellule analizzate, detection di dyes fluorescenti). Esempi di applicazioni: identificazione di diversi tipi cellulari all'interno di una campione, cell sorting, studio della proliferazione e del ciclo cellulare, misura dell'apoptosi.

- Saggi su colture cellulari.
Saggi di vitalità e mortalità cellulare: basati sull'integrità' della membrana (colorazione con trypan blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio dell'enzima glucosio 6P deidrogenasi, rilascio della lattato deidrogenasi), basati sul potenziale redox (saggio alamar-blue, saggio MTT), basati sulla funzionalità' mitocondriale (test dell'ATP).
Tecniche per lo studio di migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare (camera di Boyden, aggregati in matrigel, saggio di adesione cellulare).

ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
Durante le esercitazioni di laboratorio sarà insegnato agli studenti a lavorare in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica, introducendoli alle tecniche base di manipolazione delle colture cellulari eucariotiche. Gli studenti impareranno a valutare lo stato di salute di una coltura cellulare, a staccare le cellule mediante tripsinizzazione, a contarle e ad effettuare una semina cellulare. Sulle cellule seminate, ciascuno studente sperimenterà diverse metodiche illustrate nelle lezioni frontali, tra cui: la trasfezione (con due differenti metodiche), un saggio di vitalità cellulare, un saggio di mortalità cellulare, la valutazione dell'efficienza di trasfezione mediante utilizzo di microscopia a fluorescenza e saggio dell'attività dell'enzima beta-galattosidasi.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
DIDATTICA FRONTALE (inclusi seminari ed esercitazioni in aula)
- Analisi quantitativa dell'espressione genica: definizione e metodologie, concetti di base della PCR, schema operativo di qRT-PCR, approcci per la rivelazione dell'amplificazione in real time, metodi per l'analisi quantitativa dei dati; qRT-PCR applicata ai miRNA
- Tecniche per lo studio delle interazioni tra macromolecole: co-(immuno)precipitazione con proteine native o di fusione, GST-pull down e approcci affini, studio delle interazioni mediante FRET (in vitro e in vivo); analisi delle interazioni tra proteine e acidi nucleici mediante Electrophoretic mobility shift assay, analisi delle interazioni tra proteine e DNA nel contesto della cromatina (Chromatin immunoprecipitation), analisi delle proteine che interagiscono con RNA (RNA immunoprecipitation)
- Approcci per lo studio del proteoma: definizione generale di proteoma, di analisi proteomica e relativi approcci metodologici; applicazione della spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare delle proteine (MALDI-TOF, ionizzazione mediante electrospray); approcci per l'identificazione delle proteine: 2D-gel elettroforesi, digestione enzimatica, sequenziamento mediante tandem mass spectrometry, pattern di frammentazione dei peptidi, analisi quantitativa in spettrometria di massa
- Approcci per lo studio del metaboloma: definizione generale di metaboloma, di analisi metabolomiche e relativi approcci metodologici; targeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; untargeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, software, esempi di applicazioni; analisi statistica dei dati di metabolomica
- Approcci per lo studio del metabolismo energetico: metodi per l'analisi della morfologia mitocondriale, metodi per l'analisi della densità e della biogenesi mitocondriale, metodi per l'analisi della respirazione in colture cellulari e in modelli animali, misura della sintesi di ATP, del potenziale di membrana, delle specie reattive dell'ossigeno, e delle principali vie metaboliche mitocondriali
- Tecniche di nuova generazione per il sequenziamento degli acidi nucleici: introduzione alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione; tecnologie di sequenziamento mediante sintesi: applicazioni (interazioni DNA-proteina, RNA-seq, interazioni RNA-proteina, metilazione del DNA, whole genome sequencing, de novo sequencing); preparazione delle libraries; sequenziamento (multiplex sequencing, cluster generation); analisi dei dati

ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
- Disegno di primers e probe per Real time PCR, analisi quantitativa dei dati di qRT-PCR (laboratorio informatico)
- Isolamento di acidi nucleici da cellule in coltura, allestimento della reazione di PCR e analisi dei prodotti di amplificazione mediante elettroforesi in gel d'agarosio; frazionamento cellulare, analisi del profilo proteico delle frazioni cellulari mediante SDS-PAGE, determinazione della concentrazione proteica delle frazioni cellulari mediante metodo colorimetrico (laboratorio biologico)
Prerequisiti
Sono consigliate le seguenti propedeuticità:
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
- Biochimica
Metodi didattici
L'insegnamento si articola con lezioni frontali (2.5 CFU), seminari di esperti dei vari argomenti (0.5 CFU), esercitazioni in aula (0.5 CFU),.
Il carattere fortemente sperimentale dell'insegnamento si realizza attraverso diverse esperienze di laboratorio a posto singolo (2.5 CFU).
Materiale di riferimento
Si consigliano i seguenti testi per consultazione;
A.J. Ninfa, D.P. Ballou, Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Zanichelli
Voet & Voet, Biochimica, Zanichelli
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losic, Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli
Nelson, Cox, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli
Materiale iconografico in formato digitale fornito dal docente via internet tramite il sito Ariel
Modalità di verifica dell’apprendimento e criteri di valutazione
L'esame sarà articolato in due prove.
Prova scritta:
La prova scritta consiste in un questionario di domande a scelta multipla su argomenti dell'unità didattica di Metodologie Cellulari (15) e Metodologie Biochimiche (15). Sono ammessi all'orale gli studenti che hanno risposto correttamente ad almeno 8 domande per ciascuna unità didattica.
Prova orale:
La prova orale si svolge subito dopo la prova scritta ed è volta a completare l'accertamento delle conoscenze e della capacità dello studente di discutere i vari argomenti trattati durante il corso.
Moduli o unità didattiche
Metodologie biochimiche
BIO/10 - BIOCHIMICA - CFU: 0
BIO/13 - BIOLOGIA APPLICATA - CFU: 0
Esercitazioni: 8 ore
Esercitazioni di laboratorio a posto singolo: 24 ore
Lezioni: 8 ore
Turni:
Turno 1
Docente: De Fabiani Emma Selina Rosa
Turno 2
Docente: Audano Matteo

Metodologie cellulari
BIO/10 - BIOCHIMICA - CFU: 0
BIO/13 - BIOLOGIA APPLICATA - CFU: 0
Esercitazioni di laboratorio a posto singolo: 16 ore
Lezioni: 16 ore
Docente: Crippa Valeria
Turni:
Docente: Crippa Valeria
Turno 1
Docente: Crippa Valeria
Turno 2
Docente: Crippa Valeria
Turno 3
Docente: Crippa Valeria

Docente/i
Ricevimento:
In giorni e orari concordati con lo studente interessato, previo appuntamento telefonico o attraverso posta elettronica
ufficio del docente presso il Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari (Via Balzaretti)