Metodologie cellulari e biochimiche

METODOLOGIE CELLULARI
DIDATTICA FRONTALE
- Il laboratorio per colture cellulari eucariotiche
La sterilità, i dispositivi di protezione individuale e di protezione collettiva, le cappe di sicurezza biologica, gli incubatori, piccola strumentazione e supporti per colture cellulare. Misure di sicurezza e rischi associati.
Tecniche di sterilizzazione a calore secco e a calore umido, filtrazioni.
L'ambiente delle colture: substrati, medium di coltura, temperatura, fattori di crescita, tipi di siero e additivi chimici.

- Le colture cellulari.
Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari.
Linee cellulari primarie: ottenimento e mantenimento. Disaggregazione dei tessuti e colture primarie. Separazione e caratterizzazione di specifici tipi cellulari presenti in un tessuto.
Linee cellulari stabilizzate e/o immortalizzate: ottenimento e mantenimento. I fattori di trasformazione, l'immortalizzazione di cellule mediata da oncogeni, i sistemi ibridi ottenuti da fusioni cellulari. Immortalizzazione specifica con agenti trasformanti: tumorigenesi diretta.
Cellule staminali indotte pluripotenti (iPSC). Ottenimento, mantenimento e differenziamento.
Metodi di coltura (sospensione, adesione, coltura in monostrato e 3D), substrati per colture cellulari in adesione, analisi della morfologia delle colture cellulari. Analisi delle curve di crescita di una coltura cellulare, la subcoltura, distacco meccanico o enzimatico, la conta cellulare e la semina, il congelamento delle linee cellulari.

- Utilizzo di colture batteriche per la produzione di plasmidi per colture cellulari.
Condizioni di crescita di E.Coli, terreni liquidi e solidi, curve di crescita, congelamento e conservazione, trasformazione con DNA plasmidico, estrazione del DNA. Esempi di vettori batterici: plasmidi, batteriofago lambda e cosmidi. Elementi essenziali per un plasmide (origine di replicazione, multiple cloning site, il promotore, marcatori di selezione, l'operone lattosio e la beta-galattosidasi), strategie di clonaggio. Il fago lambda e suoi utilizzi per il clonaggio di DNA esogeno. I cosmidi.

- Tecniche di trasfezione cellulare per lo studio dell'espressione genica e per l'analisi di proteine.
I cargo genetici per sovraespressione o silenziamento genico: plasmidi a DNA (pDNA classici, enhanced episomal vectors, minicircle), oligonulceotidi antisenso, siRNA e micro-RNA.
Vettori di trasfezione non virali: metodi chimici (calcio cloruro, DEAE-destrano, lipofezione) e metodi fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun).
Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV, Herpes Simplex-based. Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus.
Trasfezioni transienti e stabili; vettori plasmidici, vettori di trasformazione con promotori virali, per espressione inducibile (tet on/tet off), sistemi reporter.
Il genome editing: le homing-endonucleases, i sistemi zinc-fingers, i TALENs, la tecnologia CRISPR/Cas9.

- La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari.
Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti. Il microscopio a fluorescenza e confocale. Immunocitochimica ed immunofluorescenza: fissaggio delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli, per misurare attività cellulari.
Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET, FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP.

- La citofluorimetria.
Introduzione alla citofluorimetria, il citofluorimetro, parametri misurabili (densità di una sospensione cellulare, complessità, dimensione e forma delle cellule analizzate, detection di dyes fluorescenti). Esempi di applicazioni: identificazione di diversi tipi cellulari all'interno di una campione, cell sorting, studio della proliferazione e del ciclo cellulare, misura dell'apoptosi.

- Saggi su colture cellulari.
Saggi di vitalità e mortalità cellulare: basati sull'integrità' della membrana (colorazione con trypan blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio dell'enzima glucosio 6P deidrogenasi, rilascio della lattato deidrogenasi), basati sul potenziale redox (saggio alamar-blue, saggio MTT), basati sulla funzionalità' mitocondriale (test dell'ATP).
Tecniche per lo studio di migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare (camera di Boyden, aggregati in matrigel, saggio di adesione cellulare).

ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
Durante le esercitazioni di laboratorio sarà insegnato agli studenti a lavorare in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica, introducendoli alle tecniche base di manipolazione delle colture cellulari eucariotiche. Gli studenti impareranno a valutare lo stato di salute di una coltura cellulare, a staccare le cellule mediante tripsinizzazione, a contarle e ad effettuare una semina cellulare. Sulle cellule seminate, ciascuno studente sperimenterà diverse metodiche illustrate nelle lezioni frontali, tra cui: la trasfezione (con due differenti metodiche), un saggio di vitalità cellulare, un saggio di mortalità cellulare, la valutazione dell'efficienza di trasfezione mediante utilizzo di microscopia a fluorescenza e saggio dell'attività dell'enzima beta-galattosidasi.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
DIDATTICA FRONTALE (inclusi seminari ed esercitazioni in aula)
- Analisi quantitativa dell'espressione genica: definizione e metodologie, concetti di base della PCR, schema operativo di qRT-PCR, approcci per la rivelazione dell'amplificazione in real time, metodi per l'analisi quantitativa dei dati; qRT-PCR applicata ai miRNA
- Tecniche per lo studio delle interazioni tra macromolecole: co-(immuno)precipitazione con proteine native o di fusione, GST-pull down e approcci affini, studio delle interazioni mediante FRET (in vitro e in vivo); analisi delle interazioni tra proteine e acidi nucleici mediante Electrophoretic mobility shift assay, analisi delle interazioni tra proteine e DNA nel contesto della cromatina (Chromatin immunoprecipitation), analisi delle proteine che interagiscono con RNA (RNA immunoprecipitation)
- Approcci per lo studio del proteoma: definizione generale di proteoma, di analisi proteomica e relativi approcci metodologici; applicazione della spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare delle proteine (MALDI-TOF, ionizzazione mediante electrospray); approcci per l'identificazione delle proteine: 2D-gel elettroforesi, digestione enzimatica, sequenziamento mediante tandem mass spectrometry, pattern di frammentazione dei peptidi, analisi quantitativa in spettrometria di massa
- Approcci per lo studio del metaboloma: definizione generale di metaboloma, di analisi metabolomiche e relativi approcci metodologici; targeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; untargeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, software, esempi di applicazioni; analisi statistica dei dati di metabolomica
- Approcci per lo studio del metabolismo energetico: metodi per l'analisi della morfologia mitocondriale, metodi per l'analisi della densità e della biogenesi mitocondriale, metodi per l'analisi della respirazione in colture cellulari e in modelli animali, misura della sintesi di ATP, del potenziale di membrana, delle specie reattive dell'ossigeno, e delle principali vie metaboliche mitocondriali
- Tecniche di nuova generazione per il sequenziamento degli acidi nucleici: introduzione alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione; tecnologie di sequenziamento mediante sintesi: applicazioni (interazioni DNA-proteina, RNA-seq, interazioni RNA-proteina, metilazione del DNA, whole genome sequencing, de novo sequencing); preparazione delle libraries; sequenziamento (multiplex sequencing, cluster generation); analisi dei dati

ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
- Disegno di primers e probe per Real time PCR, analisi quantitativa dei dati di qRT-PCR (laboratorio informatico)
- Isolamento di acidi nucleici da cellule in coltura, allestimento della reazione di PCR e analisi dei prodotti di amplificazione mediante elettroforesi in gel d'agarosio; frazionamento cellulare, analisi del profilo proteico delle frazioni cellulari mediante SDS-PAGE, determinazione della concentrazione proteica delle frazioni cellulari mediante metodo colorimetrico (laboratorio biologico)