Ree crispres - utilizzo dell'editing genomico mediante crispr/cas9 per la protezione di specie di interesse agrario

Tempo richiesto:7 giorni, 50 ore di lavoro di laboratorio; 22 ore per la preparazione della relazione finale; 3 ore per la valutazione della relazione finale (totale: 3 CFU).
GIORNO 1 (8 ore). TOFFOLATTI
· Introduzione sull'interazione pianta-patogeno (2 hr)
· Inoculazioni sperimentali plasmopara (3 hrs)
· Microscopia (3 hrs)
o Stereo microscopia su plasmopara
o Microscopia fluorescenza (Piattaforma NoLimits).
GIORNO 2 (6 ore). POZZI
· Introduzione alle new breeding technique e contestualizzazione del genome editing.
· Introduzione teorica su geni di suscettibilità e knock-out
GIORNO 3 (7 ore). DE LORENZIS
· Introduzione alle colture in vitro.
· Messa in coltura di fitomeri per micropropagazione in vitro.
· Messa in coltura di gemme ascellari per la produzione di embrioni somatici.
· Identificazione e selezione di embrioni somatici nella fase globulare.
GIORNO 4 (8 ore). BRAMBILLA
· Identificazione in silico (laboratorio informatico) dei migliori target genici per un esperimento di genome editing focalizzato sulla protezione delle piante di interesse agrario (4-5 hrs)
· Selezione degli RNA guida (utilizzo di software quali Benchling);
· preparazione degli oligonucleotidi;
· assemblaggio del costrutto virtuale.
GIORNO 5 (8 ore). BRAMBILLA
· trasformazione di E. coli con i costrutti preparati;
· trasformazione di A. tumefaciens;
· agroinfiltrazione di foglie;
· screening di trasformanti mediante PCR.
GIORNO 6 (7 ore). DE LORENZIS
· Valutazione di potenziali off-target (NGS e Sanger)
· introduzione all'uso della HRM PCR per la individuazione di off-target;
· analisi di sequenza
GIORNO 7 (6 ore). TUTTI
· Identificazione progetti per studenti
· Indicazioni circa la presentazione/elaborato finale
· Successivamente, esame da parte dei docenti dei progetti preparati dagli studenti e selezione del progetto da presentare quale esempio delle attività del laboratorio CRISPres