Metodologie cellulari e biochimiche

A.A. 2021/2022
7
Crediti massimi
84
Ore totali
SSD
BIO/10 BIO/13
Lingua
Italiano
Obiettivi formativi
L'insegnamento si propone di:
- fornire una adeguata descrizione delle tecniche utilizzate per la crescita e la manipolazione di cellule "in vitro" e sull'utilizzo dei diversi tipi di coltura cellulare in campo biotecnologico;
- presentare i principi e le applicazioni dei metodi e degli approcci di base ed avanzati per lo studio di molecole biologicamente attive e di processi biochimici e molecolari, con particolare riferimento agli approcci biotecnologici impiegati nella moderna ricerca biochimica e biomedica;
- approfondire dal punto vista metodologico le conoscenze acquisite nelle altre discipline del corso di studi svolte nei semestri precedenti (Biologia generale e cellulare, Biochimica e Biologia molecolare).
Con la parte teorica, l'insegnamento contribuisce al consolidamento delle conoscenze di base a livello molecolare e cellulare dei sistemi viventi. Attraverso le esercitazioni di laboratorio gli studenti hanno l'opportunità di familiarizzare con la manipolazione di cellule in coltura in condizioni di sterilità e con l'uso di tecniche biochimiche e bio-molecolari di base, in linea con i profili professionali e gli sbocchi occupazionali previsti per l'intero percorso formativo.
Inoltre, l'insegnamento contribuisce a fornire le basi per il proseguimento degli studi nei corsi di laurea magistrale in area biotecnologica e bio-medica.
Risultati apprendimento attesi
Al termine dell'insegnamento lo studente dovrà aver acquisito le nozioni teoriche e pratiche relative alle principali metodologie cellulari e biochimiche in uso nei laboratori di ricerca e di analisi in ambito bio-medico. In particolare, lo studente dovrà aver acquisito competenze di base per la manipolazione di cellule eucariotiche in condizioni di sterilità e la capacità di eseguire protocolli standard per l'analisi di proteine e acidi nucleici. Inoltre, lo studente dovrà essere in grado di: individuare le tecniche o gli approcci sperimentali più idonei in funzione del contesto di applicazione; individuare la soluzione corretta o più adeguata attraverso simulazioni di casi sperimentali; analizzare in modo critico i risultati ottenuti in seguito all'applicazione delle tecniche studiate e/o messe in pratica durante le esercitazioni di laboratorio.
Programma e organizzazione didattica

Edizione unica

Periodo
Secondo semestre
In relazione alle modalità di erogazione delle attività formative per l'A.A. 2021/2022, verranno date indicazioni più precise nei prossimi mesi, in base all'evoluzione della situazione sanitaria.
Programma
METODOLOGIE CELLULARI
Il corso ha lo scopo di fornire le basi relative ai metodi per l'ottenimento, la crescita e la manipolazione di modelli cellulari. Nel corso verranno trattati i seguenti argomenti:
DIDATTICA FRONTALE
- Le colture cellulari di mammifero
Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari.
Linee cellulari primarie: ottenimento e mantenimento. Disaggregazione dei tessuti e colture primarie. Separazione e caratterizzazione di specifici tipi cellulari presenti in un tessuto.
Linee cellulari stabilizzate e/o immortalizzate: ottenimento e mantenimento. I fattori di trasformazione, l'immortalizzazione di cellule mediata da oncogeni, i sistemi ibridi ottenuti da fusioni cellulari. Immortalizzazione specifica con agenti trasformanti: tumorigenesi diretta.
Cellule staminali indotte pluripotenti (iPSC). Ottenimento, mantenimento e differenziamento.
Metodi di coltura (sospensione, adesione, coltura in monostrato e 3D), substrati per colture cellulari in adesione, analisi della morfologia delle colture cellulari. Analisi delle curve di crescita di una coltura cellulare, la subcoltura, distacco meccanico o enzimatico, la conta cellulare e la semina, il congelamento delle linee cellulari.
L'ambiente delle colture: substrati, medium di coltura, temperatura, fattori di crescita, tipi di siero e additivi chimici.
- Il laboratorio per colture cellulari di mammifero
La sterilità, i dispositivi di protezione individuale e di protezione collettiva, le cappe di sicurezza biologica, gli incubatori, piccola strumentazione e supporti per colture cellulare. Misure di sicurezza e rischi associati.
Tecniche di sterilizzazione a calore secco e a calore umido, filtrazioni.
-Saggi su colture cellulari.
Saggi di vitalità e mortalità cellulare: basati sull'integrità' della membrana (colorazione con trypan blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio dell'enzima glucosio 6P deidrogenasi, rilascio della lattato deidrogenasi), basati sul potenziale redox (saggio alamar-blue, saggio MTT), basati sulla funzionalità' mitocondriale (test dell'ATP).
Tecniche per lo studio di migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare (camera di Boyden, aggregati in matrigel, saggio di adesione cellulare).
-Ingegneria cellulare: plasmidi, AON, RNAi, miRNA e genome-editing
I cargo genetici per sovraespressione o silenziamento genico: plasmidi a DNA (pDNA classici, enhanced episomal vectors, minicircle), oligonulceotidi antisenso, siRNA e micro-RNA. Il genome editing: le homing-endonucleases, i sistemi zinc-fingers, i TALENs, la tecnologia CRISPR/Cas9.
-Tecniche di trasfezione cellulare per lo studio dell'espressione genica e per l'analisi di proteine.
Vettori di trasfezione non virali: metodi chimici (calcio cloruro, DEAE-destrano, lipofezione) e metodi fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun).
Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV, Herpes Simplex-based. Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus.
Trasfezioni transienti e stabili; vettori plasmidici, vettori di trasformazione con promotori virali, per espressione inducibile (tet on/tet off), sistemi reporter.
-La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari.
Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti. Il microscopio a fluorescenza e confocale. Immunocitochimica ed immunofluorescenza: fissaggio delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli, per misurare attività cellulari.
Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET, FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP.
ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
Durante le esercitazioni di laboratorio sarà insegnato agli studenti a lavorare in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica, introducendoli alle tecniche base di manipolazione delle colture cellulari eucariotiche. Gli studenti impareranno a valutare lo stato di salute di una coltura cellulare, a staccare le cellule mediante tripsinizzazione, a contarle e ad effettuare una semina cellulare. Sulle cellule seminate, ciascuno studente sperimenterà diverse metodiche illustrate nelle lezioni frontali, tra cui: la trasfezione (con due differenti metodiche), un saggio di vitalità cellulare, un saggio di mortalità cellulare, la valutazione dell'efficienza di trasfezione mediante utilizzo di microscopia a fluorescenza e saggio dell'attività dell'enzima beta-galattosidasi.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
DIDATTICA FRONTALE (inclusi seminari ed esercitazioni in aula)
- Analisi quantitativa dell'espressione genica: definizione e metodologie, concetti di base della PCR, schema operativo di qRT-PCR,
approcci per la rivelazione dell'amplificazione in real time, metodi per l'analisi quantitativa dei dati; qRT-PCR applicata ai miRNA
- Tecniche per lo studio delle interazioni tra macromolecole: co-(immuno)precipitazione con proteine native o di fusione, GST-pull
down e approcci affini, studio delle interazioni mediante FRET (in vitro e in vivo); analisi delle interazioni tra proteine e acidi nucleici
mediante Electrophoretic mobility shift assay, analisi delle interazioni tra proteine e DNA nel contesto della cromatina (Chromatin
immunoprecipitation), analisi delle proteine che interagiscono con RNA (RNA immunoprecipitation)
- Approcci per lo studio del proteoma: definizione generale di proteoma, di analisi proteomica e relativi approcci metodologici;
applicazione della spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare delle proteine (MALDI-TOF, ionizzazione
mediante electrospray); approcci per l'identificazione delle proteine: 2D-gel elettroforesi, digestione enzimatica, sequenziamento
mediante tandem mass spectrometry, pattern di frammentazione dei peptidi, analisi quantitativa in spettrometria di massa
- Approcci per lo studio del metaboloma: definizione generale di metaboloma, di analisi metabolomiche e relativi approcci
metodologici; targeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; untargeted
metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, software, esempi di applicazioni; analisi statistica dei dati di
metabolomica
- Approcci per lo studio del metabolismo energetico: metodi per l'analisi della morfologia mitocondriale, metodi per l'analisi della
densità e della biogenesi mitocondriale, metodi per l'analisi della respirazione in colture cellulari e in modelli animali, misura della
sintesi di ATP, del potenziale di membrana, delle specie reattive dell'ossigeno, e delle principali vie metaboliche mitocondriali
- Tecniche di nuova generazione per il sequenziamento degli acidi nucleici: introduzione alle tecniche di sequenziamento di nuova
generazione; tecnologie di sequenziamento mediante sintesi: applicazioni (interazioni DNA-proteina, RNA-seq, interazioni RNAproteina,
metilazione del DNA, whole genome sequencing, de novo sequencing); preparazione delle libraries; sequenziamento
(multiplex sequencing, cluster generation); analisi dei dati
ESERCITAZIONI A POSTO SINGOLO
- Disegno di primers e probe per Real time PCR, analisi quantitativa dei dati di qRT-PCR e di metabolomica targeted, cenni di analisi secondaria e terziaria di dati di Next generation sequencing (laboratorio informatico)
- Isolamento di acidi nucleici da cellule in coltura, allestimento della reazione di PCR e analisi dei prodotti di amplificazione mediante
elettroforesi in gel d'agarosio; frazionamento cellulare, analisi del profilo proteico delle frazioni cellulari mediante SDS-PAGE,
determinazione della concentrazione proteica delle frazioni cellulari mediante metodo colorimetrico (laboratorio biologico)
Prerequisiti
Sono consigliate le seguenti propedeuticità:
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
- Biochimica
Metodi didattici
I docenti utilizzeranno a) lezioni frontali (2 CFU per l'unità didattica di Metodologie Cellulari; 1.5 CFU per l'unità didattica di Metodologie Biochimiche), b) seminari ed esercitazioni in aula (0.5 CFU per l'unità didattica di Metodologie Biochimiche), e c) esercitazioni a posto singolo in laboratorio (1.5 CFU per l'unità didattica di Metodologie Cellulari; 1.5 CFU per l'unità didattica di Metodologie Biochimiche).
Materiale di riferimento
METODOLOGIE CELLULARI
Agli studenti verranno fornite le slides presentate a lezione in pdf (piattaforma Ariel); come testo di approfondimento viene consigliato: 'Colture cellulari' di Mariantonietta Meloni, Aracne editrice.
METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Si consigliano i seguenti testi per consultazione:
A.J. Ninfa, D.P. Ballou, Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Zanichelli
Voet & Voet, Biochimica, Zanichelli
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losic, Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli
Nelson, Cox, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli
Materiale iconografico in formato digitale fornito dal docente via internet tramite il sito Ariel o altre piattaforme interattive
Modalità di verifica dell’apprendimento e criteri di valutazione
L'esame sarà articolato in due prove, una scritta ed una orale.
La prova scritta consiste in un questionario di domande a scelta multipla su argomenti trattati nelle due unità didattiche (15 per Metodologie Cellulari e 15 per Metodologie Biochimiche). Sono ammessi all'orale gli studenti che hanno risposto correttamente ad almeno 8 domande per ciascuna unità didattica.
La prova orale si svolge subito dopo la prova scritta ed è volta a completare l'accertamento delle conoscenze e della capacità dello studente di discutere i vari argomenti trattati durante il corso.
L'esame, in particolare, sarà volto a:
- valutare il livello di conoscenza e comprensione degli argomenti trattati durante il corso discutendo sia gli aspetti teorici (ad esempio i principi delle metodologie trattate) sia le applicazioni più comuni in ambito bio-medico e biotecnologico;
- verificare la capacità di applicare le conoscenze acquisite a casi specifici, prendendo spunto sia dagli esempi svolti durante le esercitazioni sia da studi pubblicati su riviste scientifiche;
- accertare la capacità di descrivere gli argomenti con chiarezza e ove richiesto con termini specifici delle discipline biologiche e biotecnologiche
La valutazione sarà espressa in trentesimi e risulterà dalla media ponderata delle valutazioni relative alle due unità didattiche.
Moduli o unità didattiche
Unità didattica: Metodologie biochimiche
BIO/10 - BIOCHIMICA - CFU: 0
BIO/13 - BIOLOGIA APPLICATA - CFU: 0
Esercitazioni: 8 ore
Esercitazioni di laboratorio a posto singolo: 24 ore
Lezioni: 12 ore
Turni:
Turno 1
Docente: De Fabiani Emma Selina Rosa
Turno 2
Docente: Audano Matteo
Turno 3
Docente: Audano Matteo

Unità didattica: Metodologie cellulari
BIO/10 - BIOCHIMICA - CFU: 0
BIO/13 - BIOLOGIA APPLICATA - CFU: 0
Esercitazioni di laboratorio a posto singolo: 24 ore
Lezioni: 16 ore
Turni:
Docente: Crippa Valeria
Turno 1
Docente: Crippa Valeria
Turno 2
Docente: Crippa Valeria
Turno 3
Docente: Cristofani Riccardo Maria

Docente/i
Ricevimento:
su appuntamento
DiSFeB, via Balzaretti 9, piano 4 e MS Teams
Ricevimento:
su appuntamento
DiSFeB - via Balzaretti 9 - piano 4
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Lunedì, mercoledì e venerdì dalle 16 alle 17 e su richiesta, previo messaggio via Microsoft Teams o email
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